ICS 11. 220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 17999.10—2008 代替GB/T17999.9—1999 SPF 鸡 微生物学监测 第 10部分:SPF鸡 间接免疫荧光试验 SPF chicken—Microbiological surveillance- Part 10:Indirect immunofluorescent assay for SPF chicken 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T17999.10—2008 前言 GB/T 17999《SPF 鸡 微生物学监测》分为10个部分： 第1部分：SPF鸡 微生物学监测总则； 第2部分：SPF鸡 红细胞凝集抑制试验； 第3部分：SPF鸡 血清中和试验； 第4部分：SPF鸡 血清平板凝集试验； 第5部分：SPF鸡 琼脂扩散试验； 第6部分：SPF鸡 酶联免疫吸附试验； 第7部分：SPF鸡 胚敏感试验； 第8部分：SPF鸡 鸡白痢沙门氏菌检验； 第9部分：SPF鸡 试管凝集试验； 第10部分：SPF鸡 间接免疫荧光试验。 本部分为GB/T17999的第10部分。 本部分代替GB/T17999.9—1999《SPF鸡间接免疫荧光试验》。 本部分与GB/T17999.9—1999相比主要变化如下： 增加了规范性附录A“试剂的配制”和资料性附录B细胞计数方法”； 详细界定了试验成立条件和待检样品的判定标准。 本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法 斯家禽有限公司。 本部分主要起草人：曲连东、刘家森、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、姜赛、司昌德、于海波、孟庆文。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T 17999.9—1999。 1 GB/T17999.10—2008 SPF鸡微生物学监测 第 10部分：:SPF鸡 间接免疫荧光试验 1范围 GB/T17999的本部分规定了间接免疫荧光试验的技术要求等。 本部分适用于对SPF鸡进行鸡传染性贫血病毒（ChickenInfectiousAnaemiaVirus，CIAV）抗体的 检测。 2原理 间接免疫荧光试验，以病毒感染细胞作抗原，与待检血清中的特异抗体结合，再与荧光色素标记的 抗抗体结合，形成抗原一抗体一抗抗体复合物。荧光色素在紫外光或蓝紫光的作用下，激发出可见的荧 光，因此出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了特异性抗体的存在。常采用已知抗原及荧光色素 标记的抗抗体检测相应的抗体。 3试剂和器材 3.1试剂 3.1.1CIAV病毒DELROSE株。 3.1.2阴性、阳性血清。 3.1.3被检血清。 3.1.4磷酸盐缓冲液（PBS)（见附录A）。 3.1.5异硫氰荧光素（FITC)标记抗鸡IgG（按说明稀释使用）。 3. 1. 6 ，缓冲甘油或封片剂（见附录A）。 3.1.7丙酮。 3.2器材 3.2.1抗原片。 3.2.2湿盒。 3.2.337℃培养箱。 3.2.4荧光显微镜。 4操作程序 4.1感染细胞的制备 用含15%新生牛血清的DMEM培养基在39C和5%二氧化碳环境中培养MDCC-MSB1细胞。 培养基，继续培养36h~48h。 4.2抗原片的制备 4.2.1细胞病变（细胞体积增大2倍~3倍）约达50%～75%时，收集细胞培养物，以1500r/min离心 10min，弃上清液，用PBS洗涤细胞沉淀物3次，并细胞计数，用PBS重悬细胞浓度 4.2.3吹干滴好的抗原片，用4℃预冷的丙酮固定10min，保存于一20℃，一周内使用。 1